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Jul 24, 2023

VEGF

Psiquiatría Molecular

Psiquiatría molecular (2023)Citar este artículo

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La activación de la inmunidad innata en el cerebro es una característica destacada de la enfermedad de Alzheimer (EA). El presente estudio investigó la regulación de la inmunidad innata mediante la inyección de suero de tipo salvaje en un modelo de ratón transgénico con AD. Encontramos que el tratamiento con suero de ratón de tipo salvaje redujo significativamente el número de neutrófilos y la reactividad microglial en los cerebros de los ratones APP/PS1. Imitando este efecto, el agotamiento de los neutrófilos a través de los anticuerpos neutralizantes Ly6G dio como resultado mejoras en las funciones cerebrales de AD. El análisis proteómico sérico identificó el factor A de crecimiento endotelial vascular (VEGF-A) y el ligando 1 de quimiocinas (motivo CXC) (CXCL1) como factores enriquecidos en muestras de suero, que son cruciales para la migración y quimiotaxis de neutrófilos, migración de leucocitos y quimiotaxis celular. El VEGF-A exógeno revirtió las disminuciones inducidas por el amiloide β (Aβ) en la quinasa 5 dependiente de ciclina (Cdk5) y los aumentos en CXCL1 in vitro y bloqueó la infiltración de neutrófilos en el cerebro con AD. La sobreexpresión endotelial de Cdk5 confirió un efecto inhibitorio sobre CXCL1 y la infiltración de neutrófilos, restaurando así las capacidades de memoria en ratones APP/PS1. Nuestros hallazgos descubren un vínculo previamente desconocido entre la señalización de VEGF derivado de la sangre y la infiltración de neutrófilos y respaldan la orientación de la señalización de Cdk5 endotelial como una posible estrategia terapéutica para la EA.

La enfermedad de Alzheimer (EA) es el tipo de demencia prevalente que afecta principalmente a pacientes de edad avanzada. La beta amiloide (Aβ) y los ovillos neurofibrilares (NFT) en el cerebro son las principales características patológicas de la EA. Cada vez hay más evidencia que sugiere que los factores circulatorios, incluidas las células inmunitarias y las citoquinas relacionadas, pueden estar asociados con cambios patológicos en modelos de ratones con EA [1,2,3,4,5]. Se ha encontrado que los neutrófilos, como los leucocitos innatos más abundantes en la sangre periférica, aumentan en la sangre de pacientes con EA con demencia [6], en el parénquima cerebral de pacientes con EA [7, 8] y en varios modelos de ratones con EA [4, 9,10,11]. Además, los factores sistémicos en la sangre de ratones jóvenes pueden rejuvenecer la neurogénesis, la plasticidad sináptica y las funciones cognitivas en ratones que envejecen [12, 13] y viceversa [14], lo que indica que los factores sistémicos juegan un papel importante en la modulación del comportamiento del huésped, la inmunidad y funciones cerebrales [15,16,17]. Por lo tanto, estos estudios sugieren que la inmunidad innata, incluidos los neutrófilos, puede desempeñar un papel crucial en el desarrollo de la EA [4, 6, 7, 8, 18]. Sin embargo, se sabe poco sobre cómo este mecanismo puede estar relacionado con las terapias que usan sangre joven y otras estrategias terapéuticas que involucran factores circulantes. Además, quedan por determinar los factores sistémicos clave que subyacen a la homeostasis de la inmunidad innata en el cerebro con AD.

Como factor transmitido por la sangre, se ha demostrado que la señalización del factor A de crecimiento endotelial vascular (VEGF-A) está involucrada en detener la neurodegeneración y el deterioro cognitivo relacionados con la EA [19,20,21]. Se ha descubierto que la señalización insuficiente de VEGF afecta el envejecimiento multiorgánico, incluida la cognición cerebral en ratones, mientras que la señalización mejorada de VEGF puede prevenir la pérdida capilar asociada con la edad en el cerebro y prolongar la vida útil [22]. VEGF-A también puede aumentar la neurogénesis del hipocampo en ratones jóvenes [23, 24] y enviar señales a las células endoteliales del hipocampo, que son sensores esenciales de los factores circulatorios relacionados con la edad [25]. Se ha encontrado que VEGF previene la pérdida del receptor AMPA inducida por Aβ y rescata la disfunción sináptica a través de la acción directa sobre las sinapsis [26].

En este estudio, revelamos que el número de neutrófilos inflamatorios disminuyó en la periferia y el cerebro en ratones APP/PS1 después de la inyección de suero de tipo salvaje. Además, buscamos descubrir el papel de la señalización del ligando 1 (CXCL1) de VEGF-A/ciclina dependiente de quinasa 5 (Cdk5)/quimiocina (motivo CXC) endotelial en el proceso de infiltración de neutrófilos en el cerebro de ratones APP/PS1. Nuestros resultados demuestran que apuntar a los neutrófilos y/o la señalización de moléculas de tráfico para reequilibrar el microambiente inmunitario en el cerebro es una estrategia prometedora para la terapia de la EA.

Se obtuvieron ratones transgénicos machos APP/PS1 (APPswePSEN1dE9) de ocho meses de edad en un fondo C57BL/6, ratones de tipo salvaje (WT) de la misma edad y ratones machos C57BL/6 de 4 a 6 semanas de edad. Instituto de Investigación Biomédica de Nanjing de la Universidad de Nanjing (Nanjing, China). Los promotores de ambos transgenes en los ratones transgénicos APP/PS1 que coexpresan el gen APP mutado en KM670/671L humano y el gen PSEN1 mutado en M146L están controlados por la transcripción de lectura completa de proteína priónica de ratón (Prn). Los ratones transgénicos Cx3cr1-GFP (B6.129P-Cx3cr1tm1Litt/J) se adquirieron en Jackson Laboratory (n.º de stock: 005582). Los animales fueron anestesiados mediante una inyección intraperitoneal (ip) de 250 mg/kg de tribromoetanol (T48402, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.) y alcohol terc-amílico al 2,5 % (240486, Sigma-Aldrich, St. Louis, EE. MO, EE. UU.) filtrado con un filtro de 0,22 µm (Millipore, MA, EE. UU.), se recogió sangre y el cerebro se perfundió con solución salina fría y/o PFA al 4 % antes de la recolección. Todos los animales se alojaron en condiciones de temperatura y humedad controladas y se mantuvieron en un entorno de ciclo de luz/oscuridad de 12 horas. Todos los protocolos experimentales cumplieron con las regulaciones del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Sun Yat-sen. Los animales fueron excluidos de los experimentos cuando mostraban un estado evidente de comportamiento similar a una enfermedad, como estar inmóviles en las pruebas OFT y MWM o morir antes o durante los experimentos.

Se recogió suero de ratón de ratones C57BL/6 macho jóvenes (n = 150; 4–6 semanas de edad) después de una hemorragia retroorbitaria. El suero se preparó a partir de la sangre completa después de la incubación durante 1 h a temperatura ambiente y a 4 °C durante la noche y la centrifugación a 4000 × g. El suero de ratón combinado se filtró a través de un filtro de jeringa estéril con un tamaño de poro de 0,22 µm (Millipore), se dializó con un casete Slide-A-Lyzer™ (Thermo Scientific) y luego se almacenó a -80 °C. Se trataron sistemáticamente ratones APP/PS1 machos de ocho meses de edad (n = 20) y compañeros de camada WT de la misma edad (n = 20) con 9 inyecciones de suero (200 μl/inyección) o una cantidad igual de PBS estéril en la cola vena cada 3 días. Todos los ratones (~9 meses de edad) se sacrificaron 48 h después de la prueba de condicionamiento del miedo; n = 7-10 para las pruebas de comportamiento y n = 4-15 para los ensayos histológicos y bioquímicos [27]. El tamaño de la muestra se eligió en base a estudios previos similares en AD [3, 4, 10]. Todas las muestras se asignaron aleatoriamente a grupos con tamaños de muestra aproximadamente equilibrados.

El condicionamiento del miedo se llevó a cabo en una cámara con dimensiones internas de 20 cm de ancho × 20 cm de profundidad × 30 cm de altura (Coulbourn Instruments, EE. UU.). Los ratones macho se colocaron individualmente en la cámara de prueba. Después de un tiempo de referencia (192 s), los animales recibieron tres emparejamientos de choque de tono. El estímulo condicionado (CS) fue un tono puro (20 s de duración, 4000 Hz, 60 dB), que fue seguido inmediatamente por una descarga eléctrica codificada continuamente entregada en el suelo de la rejilla (estímulo no condicionado, US: 2 s, 0,5 mA). Cada emparejamiento de descarga de tono fue seguido por 64 s de tiempo, y los ratones permanecieron en el contexto A durante otros 64 s después de la tercera descarga. Veinticuatro horas después del acondicionamiento, los ratones se volvieron a colocar en la cámara de prueba durante 320 s y se les calificó el tiempo de congelación (acondicionamiento contextual). Posteriormente, los animales fueron trasladados a una nueva cámara con paredes internas de plástico negro sin olor y ropa de cama en el piso y se les calificó la congelación durante un período de referencia de 192 s seguido de una exposición de 320 s a un tono idéntico al estímulo condicionado (condicionamiento con claves). ). El protocolo detallado se ha descrito anteriormente [28].

La prueba MWM se realizó con ratones macho, como se describió anteriormente con una ligera modificación [29]. Brevemente, durante la fase de adquisición, los ratones recibieron una prueba de entrenamiento por día para ubicar una plataforma oculta ubicada 1,0 cm por debajo de la superficie del agua en una piscina, utilizando las distintas señales visuales colocadas en la pared interior de la piscina. El tiempo máximo dado para cada prueba fue de 60 s. Un ratón no pudo llegar a la plataforma dentro de los 60 s y fue guiado manualmente a la plataforma y permaneció durante 10 s antes de ser devuelto a la jaula. El intervalo entre ensayos para cada ratón fue de 10 min. Durante la fase de prueba, se retiró la plataforma y los ratones recibieron una prueba única que duró 60 s sin escape disponible. Las trayectorias de natación se registraron con el sistema de seguimiento de video TopScanTM 2.0 (Clever Sys., Inc., Reston, VA, EE. UU.). Todas las pruebas de comportamiento se realizaron entre las 10:00 y las 17:00 horas en la fase de apagado.

Bajo anestesia profunda, los ratones se perfundieron transcardiacamente con solución salina estéril fría y se extrajo el cerebro inmediatamente. Un hemisferio se congeló en nitrógeno líquido y el otro hemisferio se fijó por inmersión en paraformaldehído al 4 % a 4 °C durante 24 h y se equilibró en sacarosa al 15 % en tampón de fosfato (PB) 0,1 M seguido de sacarosa al 30 %. Luego, se recolectaron secciones congeladas del hipocampo de 40 μm de espesor utilizando un micrótomo deslizante Leica SM2000R (Leica Microsystems, Richmond Hill, Ontario, Canadá) y se almacenaron a 4 °C hasta que se realizó la tinción de inmunofluorescencia. Los cortes de cerebro se seleccionaron a una equidistancia continua de cinco cortes coronales separados por 240 μm. Los hemisferios congelados se homogeneizaron y se extrajeron a 4 °C en tampón RIPA (ensayo de radioinmunoprecipitación) (Tris-HCl 50 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, Triton X-100 al 1 %, desoxicolato de sodio al 1 % y SDS al 0,1 %) que contenía inhibidores de la fosfatasa al 1 % y de la proteasa al 1 % (Sigma-Aldrich, MO, EE. UU.) usando un homogeneizador TissueRuptor (Qiagen, DUS, Alemania); el homogeneizado se centrifugó durante 30 min a 12 000 × g (Eppendorf, HAM, Alemania) y el sobrenadante se recogió como fracción soluble en RIPA. El sedimento se volvió a extraer en SDS al 2% y Tris-HCl 50 mM, pH 7,4. El sobrenadante se recogió como la fracción soluble en SDS.

Se utilizaron los siguientes anticuerpos primarios: anti-Aβ1-42 de ratón (1:1000; A5213, Sigma-Aldrich), anti-CD68 de rata (1:400; MCA1957, Bio-Rad), anti-Iba-1 de conejo (1: 1000; Wako Chemical), receptor antiglutamato de ratón 1 (1:400; ab183797, Abcam), antisinaptofisina de ratón (1:200; S5768, Sigma-Aldrich), Ly6G antiratón de rata (1:200; BP0075, Bioxcell), antimieloperoxidasa de ratón (MPO, 1:1000; AF3667-SP, I+D), antielastasa de neutrófilos de ratón (NE, 1:1 000; MAB4517-SP, I+D), anti-Ki67 de rata (1:500; SolA15 , eBioscience), anticuerpo policlonal anti-Claudin5 de conejo (1:400; YT0953, Immunoway), anti-pCdk5 de ratón (1:400; C-7, Santa Cruz) y anti-Cdk5 de ratón (1:400; DC 17, Santa Cruz ). Se utilizaron los siguientes anticuerpos secundarios: burro antiratón Alexa Fluor 647, burro antirata Alexa Fluor 594, burro anticabra Alexa Fluor 488, cabra anticonejo Alexa Fluor 555 y cabra anticonejo Alexa Fluor 488 (1: 400, Invitrogen). Se usaron anticuerpos anti-CD31 conjugados con PE (1:100; 553373, B&D), anti-CXCL1 conjugados con FITC (1:100; IC4532G, B&D) y lectina marcada con DyLight 649 (1:200; L32472, InvitrogenTM) en algunos experimentos de inmunofluorescencia. Los protocolos detallados de inmunofluorescencia se han descrito anteriormente [30].

Se utilizó un microscopio de barrido láser confocal LSM 780 u 800 (Microscopía Carl Zeiss) para capturar imágenes representativas de las secciones utilizando los mismos parámetros para evitar posibles artefactos técnicos. Se utilizó el software ImageJ (NIH) para la intensidad media de la cuantificación de la señal de fluorescencia en la región de interés de cada imagen. Para el análisis de colocalización en la Fig. 4 complementaria, análisis de distribución del perfil de intensidad de fluorescencia de Cdk5 y pCdk5 con CXCL1 usando ZEN 2.3 (Microscopía Carl Zeiss). En una descripción detallada, abra una microscopía de fluorescencia confocal usando ZEN 2.3 (edición azul) y seleccione "Procesamiento", luego seleccione "Definición de perfil", la distribución de la señal de fluorescencia podría mostrarse en gráficos a lo largo de la flecha. La lista de datos de intensidad de fluorescencia se puede encontrar en la "Tabla de perfiles". Para la reconstrucción 3D, las imágenes confocales Z-stack originales se obtuvieron utilizando una lente de inmersión en aceite de 63x con Zoom digital 2.0 mediante un microscopio LSM 780. Luego, se utilizó el software Imaris (Bitplane, versión 8.4) para renderizar y obtener imágenes reconstruidas en 3D utilizando la "herramienta de superficie". Después de la reconstrucción, se usó una herramienta de zoom digital para la ampliación de la imagen, como se muestra en la Fig. 7H (derecha) y los puntos I. GluA1+ se renderizaron usando la "Herramienta de punto". Los puntos distribuidos dentro de la microglía se definieron como puntos sinápticos engullidos. La distancia es inferior a 0 μm desde la superficie microglial y los puntos contactados distribuidos fuera de la microglia, pero la distancia es inferior a 0,25 μm desde la superficie microglial.

Para el análisis de células mononucleares de sangre periférica (PBMC), se recogieron 200 µl de muestra de sangre completa de otro grupo de ratones APP/PS1, APP/PS1 + suero y APP/PS1 + Ly6G en tubos de centrífuga de 2 ml que contenían heparina sódica al 1% ( 10 l). Después de la anticoagulación, la solución se diluyó con solución salina igualmente estéril. Las PBMC se aislaron utilizando tampón de lisis de cloruro de amonio y potasio (ACK) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los animales se perfundieron con solución salina estéril fría para eliminar la sangre periférica restante y se recogieron los cerebros. El método para la generación de células inmunitarias cerebrales se utilizó en un estudio anterior con ligeras modificaciones [31]. El cerebro se diseccionó rápidamente y se sumergió en solución salina equilibrada de Hank (HBSS) fría. El cerebro se trituró con tijeras y se homogeneizó utilizando un homogeneizador Dounce en HBSS enfriado con hielo 30 veces sin burbujas. Luego, la suspensión celular se transfirió a un tubo de 15 ml previamente enfriado y se filtró a través de una malla de nailon de 70 μm prehumedecida (HBSS). La mielina y los desechos se eliminaron utilizando un gradiente de Percoll frío modificado al 40 % (Merck Millipore, 17-0891-02) mediante centrifugación durante 30 min a 500 × g sin aceleración ni frenado. El sedimento de células inmunitarias contenía microglía, monocitos y neutrófilos en el fondo de un tubo de 15 ml. Las muestras se marcaron con anti-CD45 conjugado con FITC (0,25 mg/106 células; 11-0451-81, eBioscience), anti-CD11b conjugado con PE-Cyn7 (0,125 mg/106 células; 25-0112-81, eBioscience) , anti-CD62L conjugado con APC (0,5 mg/106 células; 553152, B&D), anti-CXCR4 conjugado con FITC (0,5 mg/106 células; 551967, B&D), anti-Ly6G conjugado con PE (0,5 mg/106 células; E-AB-F1108D, Elabscience), anti-Ly6C conjugado con EF450 (0,5 mg/106 células; 48-5932-80, Invitrogen), anti-CD31 conjugado con PE (0,25 mg/106 células; B&D, 553373, MEC 13,3 ), anticuerpos anti-VEGFR2/FLK-1 conjugados con BB700 (0,25 mg/106 células; 742184, B&D) y anticuerpos anti-CXCL1 conjugados con FITC (0,6 mg/106 células; IC4532G, B&D) a una dilución 1:100 durante 30 minutos en hielo. Las muestras experimentales se analizaron utilizando un citómetro de flujo (Beckman CytoFLEX S, CA, EE. UU.).

Los perfiles de citoquinas del suero de los grupos WT + PBS, WT + Suero, APP/PS1 + PBS y APP/PS1 + Suero (n = 1 mezcla de cuatro muestras de suero) se analizaron usando una matriz de anticuerpos de citoquinas de ratón (CAT # QAM-CAA-4000; RayBiotech, ATL, EE. UU.) y probado de acuerdo con los protocolos experimentales. Se utilizó una combinación de factores, incluida la clasificación por cambio de pliegue (<0,67 y> 1,5) y la intensidad de la señal (> 150), para identificar cambios sólidos y se generó una clasificación meta de proteínas. La intensidad de la señal relativa de las citocinas indicadas y los datos de enriquecimiento funcional de Gene Ontology (GO) se presentan en un gráfico de tendencias. El protocolo detallado del ensayo utilizando una matriz 4000 de anticuerpos de citoquinas de ratón Quantibody® se ha descrito anteriormente [32].

Los procedimientos de depleción de neutrófilos se han descrito previamente [4, 10]. Los neutrófilos se agotaron 24 h antes de la primera inyección de suero mediante inyección ip de 0,3 mg de anticuerpo anti-ratón Ly6G o control de isotipo (InVivoPlus anti-ratón Ly6G, 1A8; BE0075-1, Bioxcell, NH, EE. UU.) cada 3 días. Las inyecciones de suero y anticuerpo anti-ly6G se continuaron durante 4 semanas hasta las pruebas de comportamiento. Los niveles de neutrófilos periféricos se mantuvieron muy bajos, lo que se confirmó mediante un ensayo de inmunofluorescencia después de las pruebas de comportamiento. El procedimiento de neutrófilos fue continuo para eliminar posibles efectos de rebote.

Las concentraciones de CXCL1, CCL3, CXCL16, CXCL9, HGF, FetuinA, EGF, FGF2, IL-22, TGFB1 y VEGF-A (Beijing 4A Biotech) tanto en el suero como en el hipocampo se midieron como se describió anteriormente [29, 30] . Las muestras de sangre se centrifugaron a 4 °C (a 4000 × g durante 15 min) y los sueros se transfirieron a otro juego de tubos. Los hipocampos se homogeneizaron en tampón de lisis RIPA (Tris-HCl 20 mM (pH 8,0), NaCl 137 mM, NP40 al 1 %, glicerol al 10 %, PMSF 1 mM, aprotinina 1 μl/ml, leupeptina 1 μg/ml y sodio 0,5 mM vanadato).

Se cultivaron células endoteliales microvasculares de cerebro de ratón (MBEC, bEnd.3, Procell, CL-0598, Wuhan, China) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, las MBEC se cultivaron en suero bovino fetal al 10 %/medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) y penicilina-estreptomicina al 1 % (Life Technologies, Inc.) en matraces T75 sin recubrir a 37 °C y CO2 al 5 %. Los cambios completos de medios se realizaron cada dos días. Las MBEC se pasaron utilizando un tratamiento con tripsina al 0,25 % durante 1 min a 37 °C. Se cultivó un total de 10.000 células/cm2 en medio sin suero durante 24 h y luego se trató con suero (20 μL), anticuerpo anti-VEGF-A (2 μg) y proteína VEGF-A (20 ng/mL) durante 24 horas. h (CME0014, Beijing 4A Biotech).

Para la inactivación CRISPR/Cas9 del gen murino Cdk5 en células bEnd.3, se utilizaron los ARN guía pequeños (ARNsg): sgCDK5#1: CAGGCTGGATGATGACGATG; sgCDK5#2: CCGGGAAACTCATGAGATTG. Las secuencias de sgRNA se verificaron en la herramienta en línea NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov). Las secuencias de sgRNA se clonaron en nuestro vector pSB-CRISPR previamente construido como se describió anteriormente [33]. La eficacia de las herramientas del vector pSB-CRISPR se identificó mediante transferencia Western con un anticuerpo anti-Cdk5 específico.

Las proteínas totales se extrajeron de células bEnd.3 cultivadas y tejidos cerebrales utilizando tampón de lisis de proteínas (P0013C, Beyotime), que contenía inhibidores de fosfatasa al 1 % (Sigma-Aldrich) y cóctel de inhibidores de proteasa al 1 % (Sigma-Aldrich) y se centrifugaron a 12 000 × g (30 min, 4 °C). La concentración de proteína total se determinó utilizando un kit de ensayo de proteína BCA (Beyotime, P0012) y se ajustó a 3,5 mg/mL. Se separó un total de 30 μg de proteína mediante SDS-PAGE al 4–10 % y se transfirió a una membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF). La membrana se bloqueó con solución salina tamponada con Tris con Tween-20 (TBST) que contenía leche al 5 % y se analizó con anticuerpos monoclonales contra Ki67 (1:2000, SolA15; eBioscience), Cdk5 (1:2000, DC 17; Santa Cruz), p-Cdk5 (1:2,000, C-7; Santa Cruz), anti-receptor de glutamato de ratón 1 (1:2000; ab183797, Abcam), anti-sinaptofisina de ratón (1:2000; S5768, Sigma-Aldrich), anti-receptor de ratón -PSD95 (1:2000; ab13552, Abcam), Tau total (D1M9X, 1:2000, 46687, Cell Signaling Technology), fosfo-Tau Ser199/202 (1:2000, AB9674; Sigma-Aldrich) y anti-β de conejo -actina (1:2000, 4970; tecnología de señalización celular). Las transferencias se escanearon utilizando Image Quant Las4000mini System. Se utilizó el software ImageJ (NIH) para la intensidad media de las bandas.

A los ratones APP/PS1 se les inyectaron por vía intraperitoneal 2 μg/kg/día de VEGF-A de ratón recombinante o solución salina durante 3 días como se describió anteriormente con una ligera modificación [34]. Se inyectó sistemáticamente AAV-BR1-CMV-mCdk5-P2A-EGFP (BR1-mCdk5) o AAV-BR1-CMV-EGFP (BR1-CON) recombinante en ratones APP/PS1 de 30 semanas de edad (7,5 meses de edad) a través de la vena de la cola (mCdk5; 1,0 × 1012 partículas genómicas/ratón). El tratamiento adicional, como la inyección de suero, se realizó 2 semanas después de la inyección de AAV. AAV fue producido por un sistema de transfección de triple plásmido de acuerdo con los estudios previos [35]. En resumen, un plásmido contiene la cápside BR1, un segundo plásmido comprende el gen Cdk5 flanqueado por ITR y un tercer plásmido proporciona genes auxiliares.

Las células endoteliales primarias en el hipocampo se aislaron como se describió anteriormente [36]. Brevemente, los hipocampos de los ratones APP/PS1 tratados con BR1-mCdk5 o BR1-CON se trituraron y digirieron durante 30 min a 37 °C con FBS al 2 % (vol/vol) en PBS que contenía 400 U/ml de colagenasa. Después de la digestión enzimática, el tejido se sedimentó mediante centrifugación a 300 × g a 4 °C durante 5 min y se descartó el sobrenadante. Los sedimentos celulares se resuspendieron en FBS al 2 % (vol/vol) en PBS que contenía ADNasa I (0,5 mg/ml) y las suspensiones de células individuales se agregaron suavemente sobre Percoll al 22 % y se centrifugaron a 560 × g a 4 °C durante 10 min para obtener las células vasculares en el fondo del tubo. Las células purificadas se analizaron en un citómetro de flujo FACS Calibur (BD influxTM, NJ, EE. UU.) utilizando un anticuerpo anti-CD31-PE (0,25 mg/106 células; B&D).

Las células endoteliales del hipocampo de ratón se aislaron como se describe anteriormente [36]. El ARN total de las células endoteliales del hipocampo se aisló usando RNAiso Plus (Sangon Biotech, Shanghai, China). El ADNc se sintetizó utilizando un kit de transcripción inversa de ADNc GoScriptTM (Promega, Madison, WI, EE. UU.). La expresión de ARNm específicos se ensayó mediante PCR cuantitativa en tiempo real basada en fluorescencia (RT-PCR). Las PCR cuantitativas se realizaron utilizando TransStart Tip Green qPCR SuperMix (TransGen Biotech, Beijing, China) por triplicado para cada muestra. Los detalles de las secuencias de los cebadores son los siguientes:

Cdk5 (adelante), 59-CAATGCAGAAATACGAGAAACTGG-39;

Cdk5 (reversa), 59-CTTTGAGTAGACAGATCTCCCG-39;

Cxcl1 (adelante), 59-ACCGAAGTCATAGCCACACTC-39;

Cxcl1 (reversa), 59-CTCCGTTACTTGGGGACACC-39.

La permeabilidad de la barrera hematoencefálica (BBB) ​​se evaluó mediante tinción con azul de Evans, como se describió anteriormente con ligeras modificaciones [30]. Brevemente, se inyectó por vía intravenosa una solución al 2 % de colorante azul de Evans (E2129; Sigma-Aldrich) en solución salina al 0,9 % a los ratones APP/PS1 a través de la vena de la cola a una dosis de 2 ml/kg un día después del último VEGF-A. inyección. Dos horas más tarde, todos los ratones fueron anestesiados y perfundidos transcardiacamente con solución salina fría al 0,9%. Para detectar la fuga de azul de Evans, las muestras de tejido cerebral se homogeneizaron en dimetilformamida al 99 % y se incubaron en un baño de agua a 50 °C durante 48 h. El sobrenadante se recogió después de la centrifugación a 12 000 × g (30 min, 4 °C) y la absorbancia de la muestra se midió a 620 nm con un lector de microplacas.

Se prepararon cortes coronales de cerebro del hipocampo (300 μm de espesor) de ratones APP/PS1 machos posnatales de 5 a 6 meses de edad y sus compañeros de camada WT utilizando un vibratomo (Leica VT1000) en una solución preenfriada que contenía (en mM) 110 cloruro de colina, 7 MgCl2·6H2O, 2,5 KCl, 0,5 CaCl2·H2O, 1,3 NaH2PO4, 25 NaHCO3, 20 glucosa, saturado con 95% O2 y 5% CO2. Los cortes se transfirieron inmediatamente a líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF) a 35 °C durante 30 min y luego se transfirieron a una cámara de registro. El registro de ACSF que contiene (en mM): 125 NaCl, 2,5 KCl, 2 CaCl2·H2O, 1,3 MgCl2·6H2O, 1,3 NaH2PO4, 25 NaHCO3 y 10 glucosa. Todas las soluciones ACSF deben saturarse con carbógeno (95 % O2/5 % CO2) antes de su uso para garantizar una amortiguación estable del pH (pH 7,3) y una oxigenación adecuada. Se obtuvieron grabaciones de abrazadera de parche de células enteras del soma de las neuronas piramidales de la circunvolución dentada (DG) bajo un microscopio infrarrojo (IR) de contraste de interferencia diferencial (DIC) (ECLIPSE FN1, Nikon). Para registrar mEPSC, los potenciales de retención se mantuvieron a -70 mV, el receptor GABAA y los potenciales de acción se bloquearon con metioduro de bicuculina (BMI) 20 µM y tetrodotoxina (TTX) 1 µM, respectivamente. Las pipetas de vidrio se llenaron con una solución interna que contenía (en mM) 100 CsMeSO4, 25,5 CsCl, 10 HEPES, 8 NaCl, 0,25 EGTA, 10 glucosa, 4 MgATP y 0,3 Na3GTP (pH 7,3, 285 mOsm). Los datos se digitalizaron a 10 kHz y se filtraron a 1 kHz y se registraron usando un amplificador multiClamp 700B y Digidata 1500B con software pClamp11.2 (Molecular Devices). Los datos se recopilaron cuando la resistencia en serie fluctuó dentro del 20 % de los valores iniciales y se analizaron utilizando el programa de análisis Mini (Synaptosoft) y el software pClamp 11.2 (Molecular Devices). El método de electrofisiología se realizó de acuerdo con los estudios informados previamente [37, 38].

Un total de 100 µl de muestras de sangre completa de ratones APP/PS1 de tipo ancho y ratones APP/PS1 inyectados con suero se recogieron mediante punción cardíaca en tubos recubiertos con heparina. Todas las muestras de sangre periférica se analizaron con un analizador de hematología automático (Sysmex, XT-2000i, Sysmex Corporation, Japón). Se analizaron los siguientes parámetros sanguíneos: recuento de glóbulos blancos (WBC), recuento de glóbulos rojos (RBC), neutrófilos (Neu), linfocitos (Lym), monocitos (Mon), eosinófilos (Eos), basófilos (Bas), hemoglobina ( HGB), hematocrito (HCT), volumen corpuscular medio (MCV), hemoglobina corpuscular media (MCH), concentración de hemoglobina corpuscular media (MCHC), recuento de plaquetas (PLT), volumen plaquetario medio (MPV), ancho de distribución de plaquetas (PDW).

Todos los resultados representan al menos tres experimentos independientes y se expresan como media ± SEM. Para el análisis estadístico se realizó una prueba de la t de Student de dos colas para datos no apareados (entre dos grupos) o ANOVA de una o dos vías (pruebas de comparación de Bonferroni o LSD) o prueba de Kolmogorov-Smirnov. Se realizó ANOVA repetido de dos vías en los resultados de la prueba MWM. Se utilizó ANOVA de una vía (igual homogeneidad de varianza) o Dunnett T3 (homogeneidad de varianza desigual) para el análisis del perfil hematológico. Se supuso que la distribución de datos era normal; esto también se probó con diagramas QQ o histogramas. El análisis y la representación gráfica se realizaron utilizando GraphPad Prism versión 8.0 (GraphPad 8.0). P < 0,05 se consideró estadísticamente significativo.

La inmunidad innata se asocia con patología de EA [39,40,41]. Para investigar la respuesta de las células inmunitarias innatas al tratamiento con suero de tipo salvaje en ratones APP/PS1, utilizamos citometría de flujo para analizar las actividades de los subconjuntos de células inmunitarias CD45+ y CD45+/CD11b+ en células mononucleares de sangre periférica (PBMC, Fig. 1A, B; Fig. 1A, B) y suspensiones de células cerebrales (Fig. 1G, H). Curiosamente, después del tratamiento con suero, hubo un aumento en el número de células inmunes CD45+, pero una disminución en los neutrófilos CD11b+Ly6GhiLy6Clo, tanto en la sangre periférica (Fig. 1C, D, F) como en el cerebro (Fig. 1I, J, L) en el modelo de enfermedad. En particular, la inyección de suero elevó significativamente el recuento de células de monocitos CD11b+/Ly6Chi/Ly6Glo (Fig. 1C, E), lo cual es consistente con los resultados reflejados por CD11b+/CD45hi (Fig. 1B, C complementaria). Inesperadamente, observamos resultados inconsistentes entre los números de monocitos CD11b+/Ly6Chi/Ly6Glo (Fig. 1I, K) y monocitos CD11b+/CD45hi (Fig. 1E, F complementaria) en cerebros de ratón APP/PS1 tratados con suero. Dado que los neutrófilos pueden producir trampas extracelulares de neutrófilos (NET), analizamos la presencia de NET en el cerebro de ratones con AD mediante tinción inmunofluorescente anti-neutrófilo elastasa (NE) o anti-mieloperoxidasa (MPO). De hecho, observamos neutrófilos acompañados de NET en el parénquima, que se localizan principalmente alrededor del ventrículo cerebral, el plexo coroideo, las leptomeninges, la placa de Aβ y los vasos corticales (Fig. 2A-D). Consistentemente, el tratamiento con anticuerpos Ly6G eliminó los neutrófilos NE+ o MPO+ adyacentes al hipocampo, los espacios ventriculares y las leptomeninges en ratones con AD (Fig. 2E, F). A continuación, investigamos el fenotipo de los neutrófilos infiltrantes en un modelo de ratón con AD mediante análisis de citometría de flujo. El número de subconjuntos de neutrófilos senescentes Ly6G+/CXCR4hi/CD62Llo hiperreactivos nocivos aumentó significativamente en los cerebros de ratón APP/PS1 en comparación con los controles WT, mientras que estos efectos se evitaron mediante el tratamiento con anticuerpos neutralizantes de suero o Ly6G (Fig. 2G, H). Juntos, estos resultados sugieren que la inyección de suero en ratones con AD disminuyó el número de neutrófilos periféricos y evitó la migración del subconjunto de neutrófilos hiperreactivos al cerebro.

Estrategia de clasificación de citometría de flujo de células inmunitarias (P1), células individuales (P2), leucocitos CD45+ (P3) y monocitos CD45hi/CD11b+ (P4) en PBMC (A, B) y el cerebro (G, H). Las flechas rojas en AB y GH representan el subconjunto P2 basado en P1, el subconjunto P3 basado en P2 y el subconjunto P4 basado en P3. Los monocitos C tienen poblaciones claramente diferentes según la expresión de Ly6C y Ly6G. D–F Análisis de citometría de flujo de leucocitos CD45+ (P3), monocitos Ly6Chi/Ly6Glo (indicado por la puerta azul en C) y frecuencias de neutrófilos Ly6Ghi/Ly6Clo (indicado por la puerta roja en C) en las PBMC de PBS- y suero ratones APP/PS1 tratados. Los monocitos tienen poblaciones claramente diferentes según la expresión de Ly6C. J–L Análisis de citometría de flujo de las frecuencias de leucocitos CD45+ (P3), monocitos Ly6Chi/Ly6Glo (indicados por la puerta azul en I) y neutrófilos Ly6Clo/Ly6Ghi (indicados por la puerta roja en I) en los cerebros de PBS- y ratones APP/PS1 de 8–9 meses de edad tratados con suero (los datos se presentan como la media ± sem; prueba t de dos colas de Student no apareada, *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001 ; n = 5-6 por grupo).

Imágenes confocales representativas de leucocitos NE+ (glóbulos rojos) en el 3V (A), alrededor del área del hipocampo (paneles de la izquierda en B) y el plexo coroideo (paneles de la derecha en B). Leucocitos MPO+ (glóbulos rojos) en las meninges y el parénquima donde se deposita la placa de Aβ (tinción verde) (C) y alrededor de los vasos cerebrales (paneles de la derecha en D) en ratones APP/PS1 de 8 a 9 meses de edad. Los vasos cerebrales se identificaron en base a la tinción 3D de Hoechst utilizando el software Zen. Cuantificación del número de células NE+ (E) y MPO+ (F) en el hipocampo, 3V, vasos sanguíneos y piamadre en ratones APP/PS1 tratados con anticuerpo anti-Ly6G o anticuerpo de control de isotipo (los datos se presentan como la media ± sem ; Prueba t de Student de dos colas para datos no apareados, n = 5–6; **p < 0,01; ***p < 0,001). G, H Análisis de citometría de flujo de neutrófilos hiperreactivos que se infiltran en el cerebro, como se refleja en la tinción de CXCR4hi/CD62Llo en ratones APP/PS1 tratados con suero o anticuerpo anti-Ly6G y controles WT (n = 4–5). ANOVA unidireccional seguido de pruebas de comparación múltiple de Bonferroni. *** p < 0,001. Hipocampo de cadera, tercer ventrículo 3V, giro dentado DG, plexo coroideo CP, barra de escala: 20 μm en A y B; 50 μm en C y D.

El microambiente inmunitario circulante juega un papel importante en la homeostasis cerebral en la EA [40,41,42]. Mostramos que la inyección de suero redujo el número de neutrófilos periféricos y cerebrales en ratones transgénicos APP/PS1. Sin embargo, aún no está claro cómo los neutrófilos periféricos reducidos pueden atenuar su infiltración en el parénquima en ratones con AD. Por lo tanto, primero analizamos los perfiles de citoquinas del suero de ratones WT + PBS, WT + suero, APP/PS1 + PBS y APP/PS1 + suero usando una matriz de citoquinas de ratón. La agrupación jerárquica no supervisada basada en proteínas expresadas diferencialmente (DEP) indicó una red de expresión de proteínas distinta inducida por suero (Fig. 3A, B). Las 82 proteínas mejor clasificadas se enumeran en la Tabla complementaria 1. El análisis de Gene Ontology (GO) mostró un enriquecimiento significativo de proteínas principalmente involucradas en la migración de neutrófilos, la migración de leucocitos y la quimiotaxis (Fig. 3C, D). El análisis de la enciclopedia de genes y genomas de Kioto (KEGG) utilizando las 82 proteínas mejor clasificadas (23 reguladas a la baja y 59 reguladas al alza) reveló una red de interacciones citoquina-receptor de citoquinas y vías de señalización de quimioquinas (Fig. 2A, B complementarias).

El análisis de matriz de anticuerpos de citoquinas de ratón se realizó en el suero de ratones APP/PS1 tratados con PBS o suero (8–9 meses de edad) y ratones WT de la misma edad tratados con PBS o suero. A, B Se detectó expresión de citoquinas regulada negativamente (azul) y no regulada (roja) en el suero entre ratones WT + PBS y APP/PS1 + PBS y entre ratones APP/PS1 + PBS y APP/PS1+Serum. Análisis de enriquecimiento de ontología génica (proceso biológico) de 23 citocinas reguladas a la baja (C) y 59 citocinas reguladas al alza (D) en grupos APP/PS1+Serum frente a APP/PS1 + PBS. E Diagrama de Venn que muestra las citocinas superpuestas en el suero de los cuatro grupos. El azul representa los grupos APP/PS1 + PBS frente a WT + PBS; el rojo representa los grupos APP/PS1 + Suero vs. WT + PBS; y el verde representa los grupos APP/PS1 + Serum frente a APP/PS1 + PBS. F Análisis de mapa de calor de expresión génica de agrupamiento no supervisado que muestra las 36 citoquinas superpuestas entre el suero de ratones WT + PBS, WT + suero, APP/PS1 + PBS y APP/PS1 + suero.

Además, se identificaron 36 DEP (Tabla complementaria 2) en el suero de ratones WT + PBS, WT + Suero, APP/PS1 + PBS y APP/PS1 + Suero mediante un diagrama de Venn (Fig. 3E) y un mapa de calor (Fig. 3F). Se identificaron quimiocinas, factores de crecimiento y citocinas de los 36 DEP, incluidos CXCL1, CCL3, CXCL16, CXCL9, HGF, FetuinA, EGF, FGF2, IL-22 y TGFB1. Estos factores se enriquecen significativamente en la migración y quimiotaxis de neutrófilos/leucocitos. Además, confirmamos los resultados utilizando kits ELISA en el suero y el cerebro de ratones WT + PBS, APP/PS1 + PBS y APP/PS1 + Serum (Fig. 4A–J).

Nuestros datos mostraron que los niveles de CXCL1 (A), CCL3 (B), CXCL16 (C) y FetuinA (F) aumentaron significativamente, y los niveles de CXCL9, HGF, IL-22 y TGFB1 disminuyeron significativamente en el suero. de ratones APP/PS1 (de 8 a 9 meses de edad) en relación con los ratones WT de la misma edad (D, E, I y J). Sin embargo, estas alteraciones aumentadas se restauraron a los niveles detectados en ratones WT + PBS después del tratamiento con suero. No se observaron diferencias obvias en los niveles de EGF y FGF2 en el suero de ratones WT + PBS, APP/PS1 + PBS y APP/PS1 + suero (G, H). La red de interacción proteína-proteína K (PPI) basada en la herramienta en línea STRING que usa las 82 proteínas mejor clasificadas produjo la red más sólida en torno a la señalización de citoquinas quimiotácticas y factores angiogénicos (CXCL1 y VEGF-A). Las concentraciones medias se expresan en pg/mL de suero. ANOVA unidireccional seguido de pruebas de comparación múltiple de Bonferroni. Los datos se presentan como la media ± sem; ns no significativo; n = 6 por grupo; *p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001.

De acuerdo con los resultados de la prueba de matriz de anticuerpos de citocinas, los niveles de las quimiocinas CXCL1, CCL3 y CXCL16 asociadas con la migración de neutrófilos aumentaron significativamente en los cerebros de los ratones APP/PS1 + PBS. Después del tratamiento con suero de tipo salvaje de 4 a 6 semanas de edad, el aumento de la expresión de estas tres quimiocinas se normalizó tanto en la periferia como en el cerebro, alcanzando los niveles de ratones WT de la misma edad (9 meses) (Fig. 4A– C; Figura complementaria 3A-C). En particular, el análisis de la vía de ingenio (IPA) utilizando las proteínas mejor clasificadas produjo la red más fuerte alrededor de la señalización de CXCL1 y VEGF-A (Fig. 4K). Además, realizamos la prueba utilizando un analizador de hematología en ratones de tipo ancho, ratones APP/PS1 tratados con o sin suero. De acuerdo con los datos de las pruebas de citometría de flujo (Fig. 1E; Fig. S1C), los datos hematológicos mostraron que la inyección de suero disminuyó significativamente la cantidad de neutrófilos y aumentó los recuentos de monocitos (Tabla complementaria 3). Estos resultados indican que las quimiocinas circulantes sistémicas derivadas del suero pueden modular la infiltración de neutrófilos proinflamatorios en el cerebro en un modelo de ratón con AD.

A continuación, investigamos el mecanismo molecular subyacente a la adhesión/infiltración de neutrófilos en ratones APP/PS1. Nos centramos en la citocina CXCL1, una quimiocina atrayente de neutrófilos en el accidente cerebrovascular isquémico [43], la esclerosis múltiple [44] y múltiples modelos murinos de neuroinflamación [45,46,47]. La eliminación de Cdk5 específica del endotelio aumentó la expresión de CXCL1 y condujo a una astrogliosis progresiva en la epilepsia [48]. De acuerdo con el estudio anterior, encontramos una relación negativa entre los niveles de CXCL1 y los niveles de Cdk5/pCdk5 en células bEnd.3 después del tratamiento con Aβ o suero (Fig. 5A; Fig. 4A, B complementarias). El análisis de colocalización confirmó que las proteínas Cdk5, pCdk5 y CXCL1 existían en el citoplasma de las células endoteliales microvasculares del cerebro (Fig. 4C, D complementarias). Sin embargo, la distribución de Cdk5 y pCdk5 obviamente difería de la distribución de CXCL1 en el citoplasma (Fig. 4E, F complementaria).

A Imágenes representativas de la expresión de CDK, pCDK y CXCL1 en células bEnd.3 (CD31+). Barra de escala: 10 μm. B Transferencia Western (WB) para los marcadores de proliferación celular Ki67, Cdk5 fosforilado y Cdk5, en células bEnd.3 tratadas con Aβ (2 μM), suero (20 μL), anticuerpos anti-VEGF-A (2 μg) y proteína VEGF-A recombinante (20 ng/mL). C Cuantificación de la banda para las proteínas Ki67, pCdk5 y Cdk5 mediante análisis de transferencia Western; n = 5 por grupo. D Análisis ELISA para niveles de CXCL1 relacionados con C en el sobrenadante; n = 6 por grupo. E El inhibidor de Cdk5 roscovitina (20 μM) inhibe la fosforilación de Cdk5 inducida por VEGF-A en células bEnd.3; n = 3–4 por grupo. F Efecto de la desactivación de CDK5 usando un sgRNA en la expresión de CXCL1 en células bEnd.3 con o sin estimulación con VEGF-A; n = 6 por grupo. G, H Imágenes representativas y cuantificación de la angiogénesis cerebral (lectina+) en ratones WT, APP/PS1, ratones APP/PS1 tratados con anticuerpos anti-Ly6G o proteína recombinante VEGF-A; n = 8 ratones por grupo, se analizaron y promediaron como valor 12 campos de imagen de 5 cortes de cerebro por animal; Barra de escala: 50 μm en G. I–J Imágenes representativas y cuantificación de la adhesión de neutrófilos teñida por anticuerpo anti-MPO en capilares corticales en ratones APP/PS1 (bilineal blanco; los vasos identificados con la herramienta Z-Stack); ANOVA unidireccional seguido de pruebas de comparación múltiple de Bonferroni. ns no significativo; n = 6 ratones por grupo, se analizaron y promediaron como valor 10 campos de imagen de 4 cortes de cerebro por animal; *p < 0,05; ** p < 0,01; ***p < 0,001 para todos. Barra de escala: 20 μm en I. Los datos muestran los tres experimentos in vitro separados que produjeron resultados comparables.

Además, encontramos que VEGF-A era otra molécula clave de IPA después del tratamiento con suero (Fig. 4K), y la exposición al suero aumentó los niveles de VEGF-A circulante en ratones APP/PS1 (Fig. 5 complementaria). Además, la señalización de VEGF-A modula las funciones cerebrales en la progresión del envejecimiento [22]. La inhibición o silenciamiento de Cdk5 redujo la migración de células endoteliales y la angiogénesis al interferir con el citoesqueleto de actina [49, 50]. De manera consistente, nuestros datos mostraron que la disminución de la proliferación de células endoteliales fue paralela a la baja expresión de Cdk5 después del tratamiento con Aβ in vitro (Fig. 5B, C), lo que implica un vínculo potencial entre Cdk5 y la angiogénesis. Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que VEGF-A puede afectar la expresión de CXCL1 a través de la señalización de Cdk5. Primero, descubrimos que el suero no pudo prevenir las disminuciones inducidas por Aβ en la expresión y fosforilación de Cdk5 en células bEnd.3 después del tratamiento con anticuerpos VEGF-A (Fig. 5B, C). Similar a los efectos beneficiosos del suero, VEGF-A también previno significativamente el aumento inducido por Aβ en la expresión de CXCL1 (Fig. 5D). Para estudiar más a fondo cómo VEGF-A mediaba la baja expresión de CXCL1, examinamos la actividad de Cdk5 usando roscovitina, un inhibidor de Cdk5 (Fig. 5E). Descubrimos que la roscovitina atenuó el efecto inhibidor de VEGF-A en la expresión de CXCL1 (Fig. 6A-G complementaria). De acuerdo con estos resultados, la eliminación del gen Cdk5 endotelial en células bEnd.3 a través de la edición del gen CRISPR-Cas9 también evitó la supresión de CXCL1 mediada por VEGF-A, en lugar de inducir un aumento triple en los niveles de CXCL1 en el sobrenadante (Fig. 5F).

La adhesión de neutrófilos en los capilares cerebrales reduce el flujo sanguíneo cortical, lo que da como resultado anomalías vasculares y exacerba la patología cerebral en múltiples modelos de ratón con la enfermedad de Alzheimer [10, 11]. Observamos que el suero promovía la angiogénesis y disminuía los segmentos capilares en ratones APP/PS1 (Fig. 5G, H). Para investigar el papel de la adhesión de neutrófilos en los capilares corticales, administramos anticuerpos neutralizantes Ly6G para agotar los neutrófilos periféricos en ratones APP/PS1. Nuestros resultados mostraron que el anticuerpo Ly6G imitaba los efectos beneficiosos del suero al aumentar el número de capilares (Fig. 5G, H). De hecho, el tratamiento con anticuerpos Ly6G condujo a una reducción aproximada del 90 % en el número de neutrófilos MPO+ adyacentes a los capilares corticales (Fig. 5I, J; Fig. 2D, F). Estos datos sugieren que el suero puede aumentar la densidad de los capilares cerebrales al prevenir la adhesión/infiltración de neutrófilos.

A continuación, probamos la hipótesis de que el VEGF-A derivado del suero era necesario para el bloqueo de la adhesión de neutrófilos y la pérdida de capilares cerebrales in vivo. Por lo tanto, aplicamos proteína VEGF-A recombinante a ratones APP/PS1 y descubrimos que VEGF-A podría promover la actividad de Cdk5 y pCdk5 (Fig. 7A–F, I–N complementaria), aumentar la angiogénesis cerebral y disminuir los segmentos capilares diminutos (Fig. 5G, H), seguido de una disminución en la adhesión de neutrófilos en ratones APP/PS1 (Fig. 5I, J). De manera similar, el anticuerpo neutralizante Ly6G exhibió beneficios similares al suero y la proteína VEGF-A en el número de capilares y la adhesión de neutrófilos adyacentes a los capilares corticales (Fig. 5I, J). En particular, no observamos un empeoramiento adicional de la permeabilidad y la integridad de BBB en los cerebros de los ratones APP/PS1 tratados con VEGF-A en comparación con los ratones APP/PS1 tratados con PBS (Fig. 8A-C complementaria). Juntos, estos resultados indican que el VEGF-A derivado del suero suprime la expresión de CXCL1 a través de la actividad de Cdk5, lo que da como resultado la inhibición del reclutamiento de neutrófilos en el cerebro del ratón con AD.

A continuación, para determinar el papel de los neutrófilos migratorios en el cerebro en el deterioro cognitivo, evaluamos el aprendizaje espacial y el rendimiento de la memoria mediante el condicionamiento del miedo contextual y las pruebas del laberinto acuático de Morris. Durante el entrenamiento de acondicionamiento del miedo, todos los grupos mostraron un tiempo de congelación inicial comparable (Fig. 9A complementaria). Sin embargo, encontramos que los comportamientos de congelación aumentaron significativamente durante la prueba de memoria de miedo contextual (Fig. 9B complementaria), pero no con indicaciones (Fig. 9C complementaria) en ratones APP / PS1 después del agotamiento de los neutrófilos. El rendimiento fue similar al de los ratones WT y los ratones APP / PS1 tratados con suero (Fig. 9B complementaria). En la prueba MWM, la administración del anticuerpo Ly6G en ratones APP/PS1 también mejoró el rendimiento de la ubicación de la plataforma oculta durante la fase de adquisición (Fig. 9D complementaria). Durante la fase de sondeo espacial, los ratones APP/PS1 con agotamiento de neutrófilos pasaron más tiempo y viajaron mayores distancias en el cuadrante objetivo (Fig. 9E, F complementarias; aumentos del 46,7 % y 53,4 % para el tiempo y la distancia en el cuadrante, respectivamente) y tuvo un número significativamente mayor de pasadas a través de la plataforma que los ratones APP/PS1 (Fig. 9G complementaria; aumento de 2 veces). Además, no observamos diferencias obvias en la velocidad de natación de todos los grupos (Fig. 9H complementaria). La eficiencia de eliminación en la sangre periférica, el cerebro y las meninges se confirmó mediante análisis de citometría de flujo y tinción de inmunofluorescencia (Fig. 2A-F; Fig. 10A-F complementaria; Fig. 11A-E complementaria). Sin embargo, la administración del anticuerpo Ly6G no influyó en el porcentaje de linfocitos T CD3+ (Fig. 11F-I complementaria) ni en las condiciones de salud de los ratones APP/PS1, como se refleja en las capacidades exploratorias y la velocidad de movimiento en la OFT (Fig. 11F complementaria). . 11J–L). Estos resultados demuestran que el tratamiento con el anticuerpo Ly6G tiene efectos beneficiosos sobre el comportamiento de la memoria en ratones APP/PS1.

Para determinar aún más el papel de la señalización de Cdk5 en la infiltración de neutrófilos y los déficits de memoria en el cerebro APP/PS1, utilizamos AAV2-BR1-CMV-mCdk5-P2A-EGFP (BR1-mCdk5) para inducir la sobreexpresión de Cdk5 endotelial cerebral y llevamos a cabo el comportamiento prueba de acuerdo con el esquema experimental (Fig. 6A-D). La RT-PCR confirmó que el ARNm de Cdk5 aumentó en las células endoteliales del cerebro después de la administración de AAV (Fig. 6E, F). Se observaron aumentos similares en los niveles de proteína Cdk5 en el hipocampo mediante tinción inmunofluorescente (Figuras complementarias 12A, B).

Un esquema de los detalles experimentales. La expresión sistemática de AAV-mCdk5 se determinó en ratones APP/PS1 de 30 semanas (alrededor de 7,5 meses). Después de 2 semanas (8 meses de edad), los ratones transgénicos macho APP/PS1 tratados con AAV se inyectaron por vía intravenosa 9 veces con 200 μl de suero de ratones C57BL/6 de 4 semanas de edad cada 3 días. Los análisis de comportamiento, incluidas las pruebas de condicionamiento del miedo (FCT) y la prueba MWM, se realizaron después de la última inyección de suero. Representación esquemática de las construcciones de AAV2-BR1 que indican las repeticiones terminales invertidas (ITR) en ambos extremos y mCdk5 impulsado por el promotor de CMV con EGFP (BR1-mCdk5) o EGFP impulsado por el promotor de CMV (BR1-CON). B-D Diagrama esquemático del procedimiento de condicionamiento del miedo. B Jornada de formación (contexto I); C día de prueba contextual (contexto I); D Cued día de prueba (contexto II). E, F Los niveles relativos de ARNm de Cdk5 y CXCL1 en células endoteliales primarias del hipocampo se evaluaron en ratones APP/PS1 inyectados con BR1-mCdk5 y BR1-CON a las 32 semanas de edad (n = 4 por grupo). Imágenes confocales representativas de la expresión de CXCL1 en microvasos cerebrales (verde, G) y neutrófilos (rojo, H) en los ventrículos laterales de ratones APP/PS1 inyectados con BR1-mCdk5 o BR1-CON a través de la vena de la cola. Barra de escala: 10 μm en G; 50 μm en H. I, J Análisis de citometría de flujo representativo y cuantificación de neutrófilos (Ly6Ghi/Ly6Clo) en los cerebros de ratones APP/PS1 inyectados con BR1-Cdk5 o BR1-CON (n = 4–5 ratones por grupo). K Mapa de calor representativo de la trayectoria de escape en la fase de prueba de la tarea MWM. L BR1-mCdk5 o ratones APP/PS1 inyectados con BR1-CON (8 meses de edad) y ratones WT de la misma edad se evaluaron en la tarea MWM. M, N La frecuencia y el tiempo pasado en el cuadrante objetivo (TQ) en los grupos. O Prueba de congelación contextual. n = 7 o 10 ratones por grupo para la prueba de comportamiento. Todos los datos se muestran como la media ± sem; ANOVA repetido de dos vías, pruebas de comparación múltiple de Bonferroni; *p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001.

De acuerdo con los resultados in vitro, la expresión de CXCL1 en los vasos cerebrales disminuyó después de la sobreexpresión de Cdk5 en ratones APP/PS1, como se muestra mediante la tinción inmunofluorescente (Fig. 6G). Además, la sobreexpresión de Cdk5 endotelial resultó en una disminución de los neutrófilos migratorios al cerebro (Fig. 6H-J), acortó la latencia de escape (Fig. 6L), aumentó la frecuencia de pases a través de la plataforma (Fig. 6K, M) y la duración en el cuadrante objetivo en la prueba MWM (Fig. 6N), y el aumento del tiempo de congelación en la prueba de memoria contextual pero no con claves (Fig. 6O). Por lo tanto, estos resultados son en gran parte consistentes con los datos in vitro y demuestran que la sobreexpresión de Cdk5 disminuye la secreción de CXCL1 en las células endoteliales del cerebro.

Juntos, nuestros resultados respaldan que la señalización mejorada de Cdk5 inhibe la infiltración de neutrófilos y rescata los déficits de memoria, lo que sugiere los efectos beneficiosos del tratamiento con suero en un modelo de ratón con AD.

La pérdida sináptica generalmente se detecta temprano en pacientes con EA [51] y en modelos de ratón de la enfermedad [52]. Por lo tanto, a continuación determinamos el efecto del suero sobre el marcador presináptico sinaptofisina y el receptor AMPA GluA1. De acuerdo con estudios previos [53, 54], el modelo de ratón macho APP/PS1 de 8 a 9 meses de edad mostró una disminución significativa en la expresión de sinaptofisina y GluA1 en DG y CA3, pero no en CA1 del hipocampo, en comparación con las observaciones. en los controles WT de la misma edad (Fig. 7A-E; para sinaptofisina, disminuciones de 32,6 % y 47,8 % en DG y CA3, respectivamente; disminuciones de 42,5 % en CA3 para GluA1). Después de la sobreexpresión de Cdk5 inducida por virus, encontramos que las disminuciones en las proteínas sinápticas se restauraron significativamente en ratones APP/PS1 (Fig. 7E, F), lo cual es consistente con los resultados en ratones APP/PS1 tratados con suero y anticuerpo Ly6G (Suplementario Fig. 13A–H). Además, no se observaron diferencias en la expresión de GluA1, sinaptofisina o PSD95 en la corteza en los diferentes grupos mediante análisis de transferencia Western (Figura complementaria 13I, J).

Imágenes confocales representativas (A–D) y cuantificación (E) de sinaptofisina y GluA1 en CA1, CA3 y DG en el hipocampo de ratones WT, ratones APP/PS1 tratados con AAV-Cdk5 y los controles. IR: inmunoreactividad; Barra de escala, 100 μm. F Análisis de transferencia Western de proteínas sinápticas, incluidas GluA1, PSD95 y sinaptofisina en el hipocampo. Los datos se representan como la media ± sem; Pruebas de comparación múltiple ANOVA y LSD unidireccional, n = 4 ratones por grupo (se analizaron y promediaron como valor más de 10 campos de imagen de 5 cortes de cerebro por animal); *p < 0,05; **p < 0,01, ns no significativo. G Esquema de los experimentos en H–K. H Imágenes confocales y reconstrucción 3D de procesos microgliales (Cx3cr1-GFP) que envuelven puntos GluA1+, se evaluó el porcentaje de puntos engullidos por microglia. Los datos se representan como la media ± sem; ANOVA unidireccional y pruebas de comparación múltiple LSD, n = 5 ratones por grupo (se analizaron y promediaron como valor más de 34 microglías de 5 cortes de cerebro por animal); *p < 0,05; ** p < 0,01. I Puntos engullidos distribuidos dentro de la microglía, la distancia es inferior a 0 μm desde la superficie de la microglía; y puntos contactados distribuidos fuera de la microglia, pero la distancia es inferior a 0,25 μm desde la superficie microglial. Los puntos morados se muestran en I (abajo). J Se analizaron la reconstrucción 3D de los procesos microgliales y puntos GluA1+ en ratones WT, así como placas Aβ (azul) en ratones APP/PS1 y puntos GluA1 en contacto (menos de 0,25 μm) (n = 25–44 células de 7 ratones) . Análisis de K Sholl de microglía reconstruida en 3D (n = 14–21 células de 3 ratones por grupo). *p < 0,05; ** p < 0,01. Barra de escala: 1 μm en H, I; 5 μm en J, 10 μm en K. L Rastros representativos de mEPSC en neuronas piramidales DG de ratones de tipo ancho, ratones APP/PS1 y ratones APP/PS1 tratados con AAV-Cdk5, barra de escala: 1 s, 20 pA. M Frecuencias medias de mEPSCs. N Promedio de amplitudes de mEPSCs; prueba de Kolmogorov-Smirnov; *p < 0,05; *** p < 0,001; n = 19 o 20 células de 3 ratones/grupo en M y N.

Microglia promueve la poda de sinapsis de una manera dependiente del complemento [52]. La pérdida sináptica observada en ratones con AD puede deberse a un aumento de la fagocitosis microglial [27, 52]. Para probar si la microglía interactúa directamente con las sinapsis neuronales en el presente estudio, investigamos la asociación de indicadores fluorescentes que expresan microglía con puntos sinápticos (GluA1+) usando imágenes de reconstrucción 3D del hipocampo en ratones APP/PS1 (Fig. 7G). Clasificamos las sinapsis GluA1+ en dos subconjuntos: puntos envueltos (distribuidos dentro de la microglía a una distancia inferior a 0 μm de la superficie microglial; puntos amarillos en la Fig. 7H; puntos púrpura claro en la Fig. 7I) y puntos en contacto (distribuidos fuera de la microglía con una distancia inferior a 0,25 μm de la superficie microglial; puntos púrpuras en la Fig. 7I, a continuación). Nuestros datos revelaron que se rescataron disminuciones significativas en los puntos sinápticos GluA1+ engullidos o contactados por la microglía Cx3cr1GFP en ratones APP/PS1 sobreexpresados ​​con Cdk5 (Fig. 7H-J). El análisis de Sholl mostró que la complejidad de ramificación microglial reducida en ratones APP/PS1 se normalizó mediante la sobreexpresión de Cdk5 en células endoteliales cerebrales (Fig. 7K).

Para examinar más a fondo si la función sináptica deteriorada en ratones APP/PS1 se rescató después del tratamiento con AAV-Cdk5, examinamos las propiedades sinápticas de las neuronas piramidales en el DG. Los registros de células enteras de las neuronas piramidales mostraron que la frecuencia, pero no la amplitud, de mEPSC espontánea disminuyó drásticamente en ratones APP/PS1, mientras que estos efectos se restauraron a niveles de tipo amplio después de la sobreexpresión de Cdk5 (Fig. 7L-N). Junto con los datos de la sinapsis GluA1+, estos datos indicaron que la sobreexpresión de Cdk5 restauró las entradas sinápticas reducidas en las neuronas piramidales DG en ratones APP/PS1.

Como era de esperar, la microglía en ratones APP/PS1 que recibieron el anticuerpo IgG de isotipo mostró una morfología ameboidea, expresó altos niveles de CD68 y mostró volúmenes más pequeños (Figura complementaria 14A-C). En particular, la sobreexpresión de Cdk5, el suero y el tratamiento con anticuerpos Ly6G no solo aliviaron significativamente la activación excesiva de la microglía (Iba-1+/CD68+), sino que también cambiaron parcialmente la duración del proceso y el volumen de la microglía hacia la forma homeostática (Fig. 14A-F complementaria) . El suero no alteró las distribuciones de Aβ (Fig. 15A-D complementaria) ni RIPA y Aβ40 y Aβ42 solubles en SDS en el cerebro (Fig. 15E-L complementaria), lo que sugiere que estos efectos en la microglía son independientes de las placas de Aβ. Además, identificamos los niveles de fósforo-Tau y Tau total en el cerebro después del tratamiento con suero, que no tuvo influencia en los niveles de Tau total y fósforo-Tau tanto en el hipocampo como en la corteza del cerebro APP/PS1 (Fig. 16A complementaria). -D). Además, los multímeros Tau de 140 kDa (banda de alto peso molecular) también se midieron después de la inyección de suero. De manera similar, los niveles de Tau de alto peso molecular permanecieron sin cambios en comparación con los controles (Fig. 16A-D complementaria). En conjunto, nuestros resultados revelaron que la inhibición de la infiltración de neutrófilos por el suero mejoró el deterioro cognitivo, en parte al aliviar la pérdida sináptica y la neuroinflamación en el hipocampo del cerebro APP/PS1.

El sistema inmunitario innato, incluidos los neutrófilos periféricos y la microglía central, desempeña un papel importante en los trastornos neurodegenerativos [4, 6, 39, 55]. Los neutrófilos son las células efectoras clave de la inmunidad innata temprana y contribuyen a la inflamación en el cerebro [10, 56] y la periferia [6]. En este estudio, encontramos que la inyección de suero bloqueó el reclutamiento de neutrófilos hiperreactivos en el cerebro y redujo las trampas extravasculares de neutrófilos (NET), mejorando así el deterioro de la memoria en ratones con AD. Mecanísticamente, nuestro estudio dilucidó los mecanismos de tráfico subyacentes a la infiltración de neutrófilos relacionada con el factor sérico VEGF-A, que mediaba la actividad endotelial de Cdk5 en la disminución de la secreción de CXCL1 en el cerebro con EA. Además, revelamos que la inhibición de la infiltración de neutrófilos en el cerebro con AD por la sobreexpresión de Cdk5 endotelial y en suero mejoró los déficits de memoria, al menos parcialmente al reducir la poda de sinapsis por microglia y elevar la actividad sináptica en el hipocampo.

Investigaciones anteriores mostraron que el bloqueo de la señalización de Ly6G, un marcador específico de neutrófilos, disminuyó la migración de neutrófilos a los sitios inflamatorios vasculares y neurales [57]. Como resultado, demostramos que la inyección de suero redujo drásticamente la adherencia de los neutrófilos, particularmente cerca de los vasos cerebrales y la placa Aβ, y mejoró el deterioro de la memoria en ratones con AD. Además, después de la inyección de suero, se restauraron los segmentos de los capilares cerebrales y se bloqueó la infiltración de neutrófilos, aumentando el flujo sanguíneo cerebral y la perfusión [10], lo que mejoró las capacidades cognitivas. El análisis PPI basado en los DEP también mostró quimiotaxis mediada por citocinas derivadas del suero VEGF-A y CXCL1. Consistentemente, el VEGF-A recombinante tuvo efectos similares al anticuerpo Ly6G en el bloqueo de la infiltración de neutrófilos en el cerebro con AD. Por lo tanto, llegamos a la conclusión de que VEGF-A en suero derivado de tipo salvaje mejoró el deterioro de la memoria en ratones con AD, muy probablemente como resultado de la disminución de la infiltración de neutrófilos.

La señalización de VEGF se reduce notablemente en el cerebro con el envejecimiento, mientras que el aumento de la señalización de VEGF protege contra la pérdida capilar relacionada con la edad, el compromiso de la perfusión y la reducción de la oxigenación tisular [22], que también se observan en pacientes con EA [58,59,60]. Además, el VEGF en el LCR se asocia con el rendimiento de la memoria longitudinal, en particular en individuos con amiloide y Tau positivos [61], y las variantes relacionadas con el VEGF parecen influir en el riesgo de EA [62]. Por lo tanto, estos informes sugirieron que la señalización de VEGF está involucrada en el desarrollo de la EA. Estudios previos indicaron que la inhibición de la actividad de Cdk5 en células pituitarias de rata redujo la expresión de VEGF-A [63, 64], lo que implica que existe un vínculo subyacente entre VEGF-A y Cdk5 en el endotelio. Curiosamente, en el presente estudio, el VEGF-A recombinante previno directamente la inhibición de Cdk5 mediada por Aβ y promovió la proliferación de células endoteliales en células bEnd.3, y previno la pérdida de capilares cerebrales en un modelo de ratón con AD.

CDK5, un miembro de la familia de quinasas dependientes de ciclinas, regula la proliferación, migración y angiogénesis de las células endoteliales, y está involucrada en las principales características patológicas de la EA [65,66,67,68]. En nuestro estudio, la sobreexpresión endotelial de Cdk5 inhibió la secreción de CXCL1 y la infiltración de neutrófilos periféricos en el cerebro con AD. De hecho, un estudio anterior informó que la desactivación de Cdk5 específica del endotelio condujo a convulsiones espontáneas en ratones al aumentar la astrogliosis inducida por CXCL1 [48]. Junto con los hallazgos de una menor expresión de ARNm de Cdk5 en el hipocampo [69] y una mayor expresión del gen CXCL1 en microvasos corticales prefrontales de pacientes con DA relacionada con Tau [70], estos resultados indican que la deficiencia de Cdk5 en las células endoteliales del cerebro promueve la secreción de CXCL1 [71] . Por lo tanto, nuestro estudio demuestra que el VEGF-A derivado del suero suprime la secreción de CXCL1 al modular la actividad de Cdk5 y, por lo tanto, previene la migración de neutrófilos al cerebro.

La interacción de los neutrófilos y la microglía se ha informado en un modelo inflamatorio inducido por LPS utilizando microscopía intravital de dos fotones [72]. Además, la IL-1β derivada de la microglía y la quimiocina CXCL1 reclutan neutrófilos en un SNC infectado por hongos, de una manera dependiente del adaptador Syk CARD9 [45]. Aquí, mostramos que la activación microglial y la pérdida sináptica fueron prevenidas por el suero, la sobreexpresión endotelial de Cdk5 o el bloqueo de la infiltración de neutrófilos. Por lo tanto, los neutrófilos pueden proporcionar señales proinflamatorias para promover la poda microglial en un modelo de ratón con AD. Curiosamente, demostramos que los neutrófilos infiltrados liberaron NET en varias áreas del cerebro en un modelo de ratón con AD, lo que se evitó mediante el tratamiento con suero y anticuerpos anti-Ly6G. Esta interacción puede representar un mecanismo intrigante para la activación microglial mediada por NET y la poda de las sinapsis neuronales [73]. Se necesitan estudios futuros para explorar las funciones de los NET productores de neutrófilos en la activación microglial y la poda sináptica en un modelo de ratón con AD.

Es importante destacar que previamente habíamos demostrado que el reclutamiento de monocitos en el cerebro a través de la activación inmune podría ejercer efectos beneficiosos contra la EA [27, 74, 75]. En el estudio actual, aunque los monocitos periféricos aumentaron después del tratamiento con suero, encontramos que la infiltración de neutrófilos, en lugar de los monocitos/macrófagos, disminuyó significativamente en el cerebro de los ratones APP/PS1. Esta es la razón por la que nos centramos específicamente en las funciones cruciales de los neutrófilos infiltrantes en las patologías de EA. El rejuvenecimiento de la sangre también podría modular la expresión de varios genes involucrados en las vías de señalización neuronal hacia niveles normales. Por ejemplo, hay factores sistémicos en el plasma joven que son necesarios para los beneficios terapéuticos, incluida la activación de la señalización de Notch dependiendo de la regeneración [76], la restauración de la vía del factor de diferenciación de crecimiento 11 [12, 77], la regulación positiva de los niveles de oxitocina [78] y activación de la proteína de unión al elemento de respuesta al AMP cíclico.

VEGF-A es una citocina neuroprotectora que promueve la neurogénesis y la angiogénesis en el cerebro [79, 80]. Consistentemente, proporcionamos evidencia de que el suero rescató el nivel circulante insuficiente de VEGF-A en ratones con AD. El VEGF-A recombinante promovió la proliferación de células endoteliales in vitro y previno la pérdida capilar in vivo. Por lo tanto, VEGF-A puede ser importante para mejorar la perfusión cerebral y el flujo sanguíneo para obtener suficiente oxígeno en la sangre, especialmente en la edad [22, 79] y la enfermedad de Alzheimer [81]. Por lo tanto, la señalización endotelial de VEGF-A/Cdk5 puede ser una posible estrategia terapéutica para mejorar la patología de la EA mediante la regulación de la infiltración de neutrófilos.

Además de VEGF-A, otros factores sanguíneos enriquecidos, como VCAM1, HGF y clusterina, que están involucrados en la función de las células endoteliales vasculares, también pueden mejorar las funciones cerebrales. De hecho, una deficiencia del gen VCAM1 endotelial del cerebro contrarresta los efectos perjudiciales del plasma envejecido en los cerebros jóvenes, incluida la reactividad microglial y la función de la memoria [16]. Recientemente se ha demostrado que el HGF tiene efectos beneficiosos sobre la neurogénesis del hipocampo y la función cognitiva en ratones SAMP8, otro modelo de ratón con EA [82]. La clusterina, un inhibidor de la cascada del complemento, puede unirse a las células endoteliales del cerebro y reducir la neuroinflamación en ratones mThy-1-hAPP751 [83]. Todavía se desconoce si otros factores séricos funcionan junto con VEGF-A, pero nuestro trabajo amplía la aplicación de factores transmitidos por la sangre para restaurar las funciones cerebrales con EA. La terapia más dirigida o combinada que utiliza factores séricos justifica más estudios.

VEGF tiene funciones amplias en múltiples vías de señalización en una variedad de tipos de células. Por ejemplo, el bloqueo del efecto de VEGF en los astrocitos revirtió la descomposición de BBB [84], mientras que la inhibición de la señalización de VEGF luminal aumentó la integridad de BBB y el flujo sanguíneo cerebral y redujo la densidad capilar en ratones APP/PS1 [85]. En este estudio, observamos que una inyección de dosis baja de VEGF-A restauró la densidad capilar cerebral en la misma cepa del modelo de ratón con AD, lo cual es consistente con los datos que muestran que el tratamiento anti-VEGF redujo la densidad capilar en el trabajo de Ali. Sin embargo, no se observaron cambios significativos en la integridad y la permeabilidad de BBB en nuestro modelo de ratón AD después de la inyección de VEGF-A. La posible razón es que el modelo de ratón APP/PS1 (8 meses) que usamos es más joven que los animales (10 a 14 meses) que usamos en el estudio de Ali. Una explicación alternativa es que puede producirse un aumento transitorio de la permeabilidad de la BBB después del tratamiento con dosis bajas de VEGF-A, que puede restablecerse en varias horas [86]. Por lo tanto, comprensiblemente, la permeabilidad y la integridad de BBB no empeoraron más en los ratones APP/PS1 tratados con VEGF-A.

Además, se ha identificado que muchas proteínas circulantes están involucradas en la regulación de la permeabilidad de la BBB, como la endotelina-1 (EDN1) y el fibrinógeno (FG), que se informó que estaban aumentadas en la corteza frontal de los pacientes con EA [87]. Por lo tanto, debe dilucidarse el papel particular de VEGF-A en la permeabilidad de la BBB, la densidad capilar y el flujo sanguíneo dependiendo de los tipos de células, los modelos de enfermedad y las etapas de la enfermedad. Además, la cuestión de si el suero de 8 meses podría tener los mismos efectos positivos sobre la DA que el suero de 4 a 6 meses seguía sin resolverse. Es una limitación en el presente estudio que debe abordarse en el futuro.

Se ha propuesto que los factores transmitidos por la sangre del suero/plasma joven o del ejercicio benefician las funciones cerebrales, incluida la neurogénesis, la plasticidad sináptica y la inflamación, así como el aprendizaje y la memoria, tanto en animales de edad avanzada como en modelos de ratones con AD. Por lo tanto, la aplicación de factores sanguíneos en otras enfermedades neurodegenerativas merece consideración. Nuestros datos proporcionan evidencia de que la señalización de VEGF-A/Cdk5 endotelial media las moléculas de tráfico de neutrófilos, lo que destaca que el VEGF-A/Cdk5 endotelial del cerebro puede servir como un objetivo terapéutico potencial para la enfermedad de Alzheimer (Fig. 8).

El papel propuesto de la señalización endotelial de VEGF-A/Cdk5/CXCL1 en el proceso de infiltración de neutrófilos en el cerebro en ratones con AD. El VEGF-A derivado de suero de tipo salvaje suprime la expresión de CXCL1 endotelial vascular cerebral a través de la regulación positiva de la actividad de Cdk5, lo que detiene el reclutamiento de neutrófilos en el cerebro en ratones con AD y mejora el deterioro de la memoria. VEGF-AR Receptor VEGF-A, CXCR2 CXC motivo receptor 2 de quimiocinas.

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Descargar referencias

Agradecemos a la Sra. Lin Zhang, al Dr. Hongyang Zhang y a Bs. Zhenyan Yu por su amable apoyo. También agradecemos a la Sra. Qunfang Yuan y al Dr. Juntao Zou por las sugerencias para los experimentos relacionados con la inmunidad innata. Agradecemos a Core Lab Platform for Medical Science of Zhongshan School of Medicine, Sun Yat-sen University.

Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias de China (82271473, 81971021, 81901339, 82172547 y 82172636), los Fondos de Investigación Fundamental para las Universidades Centrales (19ykpy99), la Ciencia Innovación 2030-Ciencia del cerebro y tecnología de inteligencia inspirada en el cerebro (2021ZD0201100 y 2021ZD0201102), el proyecto de planificación de ciencia y tecnología de Guangzhou (202002030441) y la Fundación de Ciencias Naturales de la provincia de Guangdong, China (2019A1515011184, 2020A151501001).

colmillo colmillo qi

Dirección actual: Departamento de Neurología, Clínica Mayo, Rochester, MN, 55905, EE. UU.

Estos autores contribuyeron por igual: Fangfang Qi, Zejie Zuo, Kaishun Hu, Shengwen Wang, Long-Jun Wu, Kaihua Guo.

Departamento de Anatomía y Fisiología, Laboratorio Clave de Función y Enfermedad Cerebral de la Provincia de Guangdong, Centro de Tecnología Médica Avanzada, El Primer Hospital Afiliado, Escuela de Medicina Zhongshan, Universidad Sun Yat-sen, Guangzhou, 510080, China

Fangfang Qi, Rui Wang, Tong Wu, Hao Liu, Jiaoling Tang, Qingbo Wang, Yunjie Yang, Jie Xu, Zhibin Yao y Kaihua Guo

Departamento editorial de la revista de la Universidad Sun Yat-sen, Guangzhou, 510080, China

colmillo colmillo qi

Departamento de Medicina de Rehabilitación, Tercer Hospital Afiliado, Universidad Sun Yat-sen, Guangzhou, 510630, China

zejie zuo

Laboratorio clave provincial de Guangdong de epigenética de tumores malignos y regulación genética, Laboratorio conjunto de medicina de ARN de Guangdong-Hong Kong, Sun Yat-sen Memorial Hospital, Sun Yat-sen University, Guangzhou, 510120, China

kaishun-hu

Programas de cinco años de Medicina Clínica en el grado 2017, Escuela de Medicina, Universidad Sun Yat-sen, Shenzhen, 528406, China

Yufeng Xie

Departamento de Neurología, Sun Yat-sen Memorial Hospital, Universidad Sun Yat-sen, Guangzhou, 510120, China

Liren bronceado

Centro de Biología de Células Madre e Ingeniería de Tejidos, Laboratorio Clave para Células Madre e Ingeniería de Tejidos, Ministerio de Educación, Universidad Sun Yat-sen, Guangzhou, 510080, China

Xiaoran Zhang

Departamento de Neurología, Clínica Mayo, Rochester, MN, 55905, EE. UU.

Jiaying Zheng y Long-Jun Wu

Departamento de Neurocirugía, Sun Yat-sen Memorial Hospital, Sun Yat-sen University, Guangzhou, 510120, China

ShengwenWang

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KG, KH, L-JW y FQ contribuyeron al diseño de este estudio y al análisis de los datos. SW, L-JW y FQ escribieron el manuscrito. FQ, SW, ZZ, RW, YX, HL, JT y TW realizaron la mayoría de los experimentos, incluida la evaluación del comportamiento, el microscopio de barrido láser confocal y los experimentos de bioquímica. Suero administrado por XZ y QW. LT realizó los experimentos in vitro. Todos los autores restantes participaron en la generación de los datos originales y brindaron una evaluación crítica del manuscrito. Todos los autores aprovaron el manuscrito final.

Correspondencia con Shengwen Wang, Long-Jun Wu o Kaihua Guo.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Reimpresiones y permisos

Qi, F., Zuo, Z., Hu, K. et al. VEGF-A en suero protege contra el deterioro de la memoria en ratones transgénicos APP/PS1 al bloquear la infiltración de neutrófilos. Mol Psiquiatría (2023). https://doi.org/10.1038/s41380-023-02097-w

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Recibido: 28 julio 2022

Revisado: 17 de abril de 2023

Aceptado: 27 de abril de 2023

Publicado: 06 junio 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41380-023-02097-w

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